所谓离子交换，是指溶液中的某一种离子与另一种靠静电力结合在惰性载体上的离子进行可逆交换的过程，即溶液中的离子结合到载体上而载体上的离子被替换下来。若惰性载体上以共价键结合着带正电荷的活性基团，则可交换阴离子，叫阴离子交换剂;若以共价键结合着带负电荷的活性基团，则可交换阳离子，叫阳离子交换剂。在一定的条件下，混合物中不同蛋白质所带电荷的性质及电荷多少不同，有的能与特定离子交换剂结合，有的不能结合;能与离子交换剂结合的蛋白质中，结合力的大小也不一定相同，所以，采用适当的洗脱条件，可以对它们进行有效的分离。离子交换过程可以表示如下：
■一R+Y一+x一→■一R+X一+Y一
(阴离子交换) ■一R—Y++x+→■一R—X++Y+ (阳离子交换)
上式中，■代表惰性载体;R代表惰性载体上的活性基团;Y代表平衡离子(可替换离子); x代表蛋白质分子。
样品进入离子交换柱之前，共价结合于惰性载体上的活性基团大部分处于溶剂化状态，并吸附着平衡缓冲液中带相反电荷的离子。蛋白质样品进入离子交换柱后，由于分子表面一些基团的电荷性质与交换剂上活性基团的电荷性质相反，因而会通过静电引力结合于交换剂上，并把其原来吸附的平衡离子取代下来。 蛋白质是两性电解质，它与离子交换剂的结合力取决于分子表面能够与离子交换剂形成静电键的数目，而后者首先与分子所携带的电荷的数目有关，其次与蛋白质分子的大小及电荷排列也有一定关系，因为它们与蛋白质分子是否易于在离子交换剂上的适当部位形成静电键有关。总的来说，蛋白质分子与交换剂之间存在三种不同的结合状态：①蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目很多，以致它们同时解离的机率等于零。洗脱时，这部分蛋白质由于结合紧密而停留在柱顶端。②蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目相对较少，它们同时解离的机率达到某一有限值(0～1之间)。洗脱时，某一种蛋白质分子的静电键在某一时间里同时解离，随洗脱液向下移动。③蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目极少，不与交换剂结合。处于这种状态的蛋白质分子随洗脱液的前峰移动，呈现一个高而窄的“穿过峰’’(“不交换峰”)。如果混合物中有几种蛋白质同时处于这种状态，那么它们会同时被洗脱下来，达不到分离目的。采用阳离子交换剂时，带负电荷的蛋白质分子不能结合而呈“穿过峰”洗脱下来。
蛋白质分子在离子交换剂上的结合状态是随着环境条件的变化而改变的。洗脱就是通过改变缓冲液离子强度或/和pH来改变蛋白质与交换剂的结合状态，降低其与交换剂的结合力，使交换上去的不同蛋白质分子以不同速度洗脱下来，达到分离纯化的目的。增加缓冲液的离子强度时，由于洗脱液中高离子强度竞争性离子的存在，与交换剂结合的蛋白质分子被取代下来进入洗脱液中。洗脱液中离子种类不同时，取代能力不一样。改变缓冲液的pH时，蛋白质分子的解离度降低，电荷减少，从而减弱其与交换剂的结合力。应用阴离子交换剂时要降低pH;应用阳离子交换剂时要升高pH。有时，同时改变两个方面的条件，有利于分离复杂的蛋白质混合物。在恒定的洗脱条件下，往往难以将复杂的蛋白质混合样品有效地分离。通常采用不断改变洗脱条件的方法，即用梯度洗脱的方法来分离蛋白质混合样品。
虽然离子交换层析法分离蛋白质时，主要通过离子交换的作用，但实际上也可能存在 一些疏水吸附和分子筛作用。
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