酶联免疫吸附（ELISA）实验

实验方法原理：

本法首-先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。

这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定。HbSAg及HbS的测定。

实验材料：血清 血浆 体液

试剂、试剂盒：碳酸盐包被缓冲液 抗体球蛋白 吐温 柠檬酸 硫酸

仪器、耗材：酶标比色计 96孔板 移液枪 离心管 离心管盒

实验步骤：

一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。

二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。

四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。

六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。

七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。

八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。

九、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。

注意事项：

1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙-烯、聚乙-烯及聚氯乙-烯等等。但在ELISA中-常用的是聚苯乙-烯或聚氯乙-烯微量反应板及塑料管。

2.包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。

3.对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。

4.用-适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定OD值，选择OD值≥1.0的那个抗原稀释度为适包被浓度。一般总是要选择那个OD值稍大于1.0，而不选择小于1.0的抗原浓度。阴性参考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的OD值有明显差别。

5.抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。但为了方便起见，通常采用4℃包被过夜，可使抗原吸附得更加*且均匀。在用聚苯乙-烯或聚乙-烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4℃包被过夜较为合适。但在某些试验中，如用LPS或毒素蛋白包被时，用PH 7.2-7.4 PBS稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为1-10 ug/ml，而对某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml较为合适，但均应通过滴定。