Elisa常见样本的处理方法

Elisa常见样本的处理方法

Elisa 是一种快速、灵敏、准确可靠的一种定量分析方法，样本的处理对于 Elisa 实验的成功有着举足轻重的作用。利用 ELISA 进行检测的样本类型包括常 见的血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清以及不常见的 皮肤组织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、液、道分泌物等，这些样本收集的时间、处理方法和保存都会影响到 Elisa 实 验的结果。下面我们就常见的样本处理方法，供研究者参考。

1、 血液样本

血液采取后应尽快进行处理，使血清（浆）从与血细胞接触的全血中分离 出来。

血清与血浆的区别：

血清是血液凝固后缺少纤维蛋原的血浆，故血浆中除尚含有纤维蛋白原和 抗凝剂外，其他成份均等同于血清。

选择血清还是血浆样本？

由于血清中缺乏很多的*，但有一些凝血产物，如果是测* 建议选择血浆样本；同时血浆中有纤维蛋白原，如果纤维蛋白原对待检测指标 有影响，建议选择血清样本。大多数情况下二者均可以选择。

处理方法：

血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4 度过夜，然 后 1000×g 离心 20 分钟，取上清即可。这是一个让血液自然凝固的过程，温度 温度越低，凝集越缓慢，可根据需要添加促凝剂。

血浆：血浆样本需要抗凝，一般建议用 2.0%EDTA，1%肝素，3.8%枸橼酸 钠作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 2 ~8 度 1000 g 离心 15 分钟，取上清即可检测。根据待检测目标物的性质不同选取不同的抗凝剂。

*(柠檬酸钠）：Ca2+有凝血作用，*能与血液中的钙离子形 成可溶性的螯合物，从而阻止血液凝固。配成 109mmol/L 的浓度和血液 1:9, 106mmol/L 的浓度和血液 1:4。

缺点：血液中溶解度低，抗凝作用较弱。

优点：对*有很好的保护作用，大部分凝血试验都可用*抗 凝。

乙二胺四乙酸（EDTA）盐：与血液中的钙离子结合形成配位化合物， 从而阻止血液凝固。15g/L EDTA 和血液 1:10。

优点：对红细胞和白细胞形态影响小。

缺点：影响血小板的聚集。不适用于凝血实验和血小板功能相关实验的检 测。

肝素：通过与抗*Ⅲ结合，增强抗*的作用，灭活*蛋白 酶，从而可阻止*的形成和阻止血小板聚集，阻止血液凝固。* 1g/L 与血液 1:10。

优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温。

缺点：引起白细胞聚集。肝素抗凝血应于短时间内使用，否则放置过久血 液又可凝固。

2、 组织样本

组织样本一般是制成组织匀浆，处理方法如下。

1）取适量组织块，于预冷 PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液， 称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）；

2）可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃 匀浆器，加入 5-10ml 预冷 PBS(组织与 PBS 的质量体积比建议为 1:5，即 1g 样 本加入 5ml PBS)进行充分研磨（有条件实验室可选用机器匀浆），该过程需在冰 上进行；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过 程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复 2 次）。

3）将制备好的匀浆液于 5000×g 离心 5 分钟，留取上清即可检测。

4）如果样本需要*保存，请添加蛋白酶抑制剂。根据实验需要，组织匀 浆样本可先定量总蛋白,以便于统计分析数据。某些组织样本如肝脏，肾脏，脑 组织会有假阳性反应。

3、 细胞样本 细胞样本根据目的物所在部位可选择细胞裂解液或细胞培养上清作为样 本。需要注意的是：因该类样本干扰因素较多，如细胞状态、细胞数量(大于 10^6)、 ph(约为 7)、培养基盐离子浓度、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。 如果目的物是分泌型，主要在胞外，即可选择细胞培养上清作为样本，如果目 的物主要存在于胞内，则建议选择细胞裂解液作为样本类型。

细胞培养上清处理方法相对简单，取细胞培养上清，1000×g 离心 20 分 钟，取上清即可检测。

细胞裂解液：

1）贴壁细胞需要先用*消化，离心收集细胞（悬浮细胞可直接离心收 集）；

2）将收集到的细胞用冷 PBS 洗 3 次；

3）物理方法裂解细胞（可先超声破碎细胞，再反复冻融）：

    i 超声破碎：取适量 PBS 重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞 悬液，使细胞急剧震荡破裂；

    ii 反复冻融：将待破碎的细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复 3 次，使细胞溶胀破碎；

4）将标本于 2-8 度 1500×g 离心 10 分钟，收集上清备用。

一般情况下，物理方法如反复冻融，匀浆等方法会比化学方法好，因为化 学方法会引入酸或碱，可能会对 elisa 实验产生影响。我们也做了相关实验来评 测化学提取液和洗涤剂对 ELISA 检测的影响，如 RIPA、TritonX-100、NP-40 和 SDS、脱氧胆酸钠、β巯基乙醇、DTT