体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光（TMRM）试剂盒资料
主要用途活体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光（TMRM）测定试剂是一种旨在通过四甲基罗丹明甲酯染料，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，其荧光的增强或减弱说明线粒体膜电位的变化，即内膜电负性的增高或降低，来分析线粒体内膜功能的完整性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种线粒体制备物的功能检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老等的研究。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简易，性能稳定。

技术背景

体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光（TMRM）试剂盒资料

四甲基罗丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），为罗丹明衍生物阳离子染料，作为电势测定（potentiometric）荧光探针：*，具有亲脂性，且细胞低毒和光稳定； 第二，与线粒体内膜负电极结合而聚集；第三，容易进入细胞及其线粒体。四甲基罗丹明甲酯进入细胞后，被细胞内酯酶切离，产生四甲基罗丹明。四甲基罗丹明进入线粒体后，被线粒体俘获，分布和结合在线粒体内膜上，呈现强烈荧光。线粒体膜电位的高低变化决定了TMRM的分布浓度。电位高，TMRM在线粒体的浓度高，显示为强力红色或桔红色；反之，TMRM弥散在胞浆内，荧光减弱表明线粒体膜电位受到损害。 

 

产品内容

 

染色液（Reagent A）    100微升

稀释液（Reagent B）     10毫升

清理液（Reagent C）     50毫升

强化液（Reagent D） 1毫升

产品说明书 1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；染色液（Reagent A）避免光照；有效保证6月

 

用户自备

体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光（TMRM）试剂盒资料

*乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（GMS12052）：用于细胞脱落收集

1.5毫升离心管：用于活体细胞线粒体染色的容器

微型台式离心机：用于细胞收集的操作

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于活体细胞线粒体荧光定性分析

比色皿或96孔板：用于荧光定量分析的容器

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于活体细胞线粒体荧光定量分析

细胞流式仪：用于活体细胞线粒体荧光分析

 

实验步骤

 

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent B）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出10微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管，加入890微升稀释液（Reagent B），混匀后，在冰槽里静置，并标记为染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

 

一、直接法

 

• 准备1个24孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约10⁵细胞数）
• 小心抽去细胞培养液
• 轻轻沿着孔壁加入1毫升 清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面
• （选择步骤）加入50微升强化液（Reagent D），轻轻混匀
• （选择步骤）冰上孵育5分钟
• 小心抽去1毫升 清理液（Reagent C）
• 加入450微升含有染色液（Reagent A） 和稀释液（Reagent B）的染色工作液，覆盖培养孔表面
• 放进37℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）
• 小心抽去450微升染色工作液
• 小心加入500微升清理液（Reagent C）（注意：检测前置于冰槽里）
• 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察（滤波器激发波长540nm，散发波长580nm ）――可见

亮橘红色荧光；如果强度显著减弱，表明线粒体膜电位受到破坏

 

二、间接法

 

• 准备1个12孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约30万细胞数）
• 小心移出细胞培养液到15毫升锥形离心管（收集悬浮细胞）
• 加入1毫升 清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面
• 小心移出1毫升 清理液（Reagent C）到15毫升锥形离心管（收集洗脱细胞）
• 加入500微升用户自备的*乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养孔表面
• 置入37℃培养箱1分种
• 轻轻抖动培养板，使细胞脱落，然后加入1毫升*细胞培养液
• 移入15毫升锥形离心管
• 放进 台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入50微升清理液（Reagent C）
• 用200微升枪头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群
• 转入到1.5毫升离心管或细胞流式仪测试管
• 加入450微升含有染色液（Reagent A） 和稀释液（Reagent B）的染色工作液
• 轻度涡旋震荡2秒
• 放进37℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）
• 放进 台式微型离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升清理液（Reagent C）（注意：检测前置于冰槽里）

 

选择一、（共聚焦）荧光显微镜观察 

 

• 混匀后，移出50微升在载玻片上
• 即刻进行载玻片压片，在荧光显微镜下进行观察（滤波器激发波长540nm，散发波长580nm） ――可见亮橘红色荧光；如果强度显著减弱，表明线粒体膜电位受到破坏

 

选择二、细胞流式仪分析

 

• 混匀后，即刻进行细胞流式仪分析：观察50000个细胞以上

 

激发波长	488nm
匹配荧光染料	藻红蛋白（phycoerythrin；PE）
荧光颜色	红色
散发波长	575
流式仪通道	FL2
荧光增强	膜电位正常

 

选择三、荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定

 

• 混匀后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里
• 即刻进行荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定（激发波长540nm，散发波长580nm），获得相对荧光单位（RFU）：RFU值高表明线粒体膜电位正常

 

注意事项

 

• 本产品为20次（0.5毫升工作液）操作
• 操作时，须戴手套
• 待测细胞建议不要过于饥饿或过度生长
• 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析
• 孵育时，避免光照
• 健康细胞和线粒体呈现橘红色；死亡或凋亡细胞及损伤线粒体呈现黯淡或无荧光
• 本公司提供FCCP溶液，作为线粒体膜电位破坏分子，观察荧光显著减弱现象
• 参考图像

• 荧光显微镜：左侧为正常样品；右侧为处理样品 

 

2）细胞流式仪：上图为正常样品；下图为FCCP处理样品

 

• 本公司提供系列线粒体试剂产品