上海信裕生物科技有限公司
主营产品: ELISA试剂盒,检测试剂盒,白介素试剂盒,试剂盒,重组蛋白,单克隆抗体,多克隆抗体,细胞系,原代细胞,胎牛血清,生化试剂,实验室耗材,abcam抗体等科研产品 |
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2017-8-4 阅读(212)
细胞冻存、复苏策略
一般来说,细胞进行转移,的策略是进行低温保存(-70℃~-196℃),而细胞深低温保存的基本原理是:在-70℃以下时,细胞内的酶活性均已停止,即代谢处于*停止状态,故而可以*保存。细胞低温保存的关键,在于通过0~20℃阶段的处理过程,在此温度范围内,冰晶呈针状,极易招致细胞的严重损伤。
经过前人的*试验,发现细胞的冻存及复苏基本原则是慢冻快融,这样科研zui大限度的保存细胞活力。
一、材料准备
1、仪器:净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。
2、玻璃器皿:吸管(弯头、直头)、培养瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、废液缸。
3、塑料器皿:吸头、枪头、胶塞、移液管(10ml)、15ml离心管、冻存管(1~2ml)。
4、其他物品:微量加样枪、红血球计数板、记号笔、*、移液枪。
5.PBS,胎牛血清,DMSO,培养液,双抗,*(0.25%)
二、细胞冻存
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由冰晶形成的细胞损伤。
1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。
2、取对数生*的细胞,用*把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。
3、离心1000 rpm,5 min.
4、去除*及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的zui终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml.
5、 在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者。
6、 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达到-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。
三、细胞复苏
1、从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
2、从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀。
3、离心,1000 rpm,5 min。
4、弃去上层清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养。
5、次日更换一次培养液,继续培养。