感受态细胞制备原理与操作

原理： 
 
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。转化效率可达106-107转化子/微克DNA。 
 
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生*，实验操作必须在低温下进行。 
 
操作： 
 
1、取-70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。 
 
2、第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min） 
 
3、当菌落600nm OD值达到0.3-0.4时，将烧瓶取出放置冰上10~15分钟。在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。4℃，4000g离心10分钟。 
 
4、弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。 
 
5、4℃，4000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2, 重悬浮菌体。每管0.2ml分装，至4℃保存备用，24-48小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于-70℃的低温冰箱中。