ELISA试剂盒按规定的量加入板孔中

在早期的间接法ELISA试剂盒中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是，ELISA试剂盒N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。阳性判定值（cut-off value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。ELISA试剂盒用此法判断结果要求实验条件十分恒定，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。

1 目测定性法：加入底物经酶解和终止反应后，肉眼观察阳性孔颜色明显深于(竞争法则浅于)阴性对照；与阴性对照的颜色接近者，判定为阴性。

2 以样品孔的OD值大于阴性对照OD值+2～3SD，作为阳性结果的阈值。

3 以P／N值(阳性孔OD值／阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性；P／N值小于2.1，但大于1.5为可疑；P／N小于1.5为阴性。

    在ELISA试剂盒中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA试剂盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器。每次加标本应更换吸嘴，以发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法ELISA)需用稀的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。